对多相参数检测的论文

FLAER多参数检测PNH克隆的影响论文

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，其发病机制主要是由于体细胞X染色体上的PIG-A基因突变，导致血细胞膜表面糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成障碍，锚连接蛋白缺失。传统的诊断方法主要有蔗糖溶血试验、酸溶血试验、尿含铁血黄素试验，但这些方法敏感性、特异性差。近些年来，通过流式细胞仪检测CD55、CD59已经成为诊断PNH的常规方法，特别是CD59，其敏感性高于CD55，在PNH 诊断过程中被认为是一个优于CD55 的指标。荧光标记的无活性嗜水气单胞菌溶素前体的变异体(FLAER)可以特异性的与GPI锚连蛋白结合，经流式细胞仪检测，其特异性和敏感性较传统方法更好。PNH、再生障碍性贫血(AA)和骨髓增生异常综合征(MDS)均为骨髓衰竭性疾病，具有相似的发病机制和临床表现，早期鉴别诊断常很困难。本文联合FLAER、CD45、CD15、CD24 多参数检测粒细胞PNH克隆以及CD59检测红细胞PNH 克隆，旨在有效提高PNH克隆检测的敏感性、特异性，有助于骨髓衰竭性疾病的早期鉴别诊断，现报道如下。

1 资料与方法

一般资料 所有病例均来自于本院血液科连续48例住院患者。其中PNH患者9例，AA患者13例，诊断均符合血液病诊断及疗效标准;MDS患者11例，符合2008年WHO诊断分型标准。对照组15例均为巨幼细胞性贫血患者。

仪器与试剂 FACSAria型流式细胞仪，溶血素、磷酸盐缓冲液(PBS)和CD59、CD45、CD15、CD24试剂和均购自BD公司，FLAER试剂购自加拿大Protox Biotech公司。

方法

外周血红细胞CD59检测 取EDTA 抗凝全血100μL，经PBS洗涤后稀释于的PBS中，取100μL加入CD59-PE单抗20μL，4℃避光孵育30min后，1 000r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS液洗涤2遍，重悬于1mL PBS液中上机检测，用流式细胞仪测定CD59细胞的表达率。

外周血粒细胞FLAER检测 取EDTA抗凝全血100μL，加入CD45、CD15、CD24、FlAER抗体各20μL，避光孵育30min后，加入2mL溶血素，室温下避光10min，溶血完全后1 000r/min离心5min，弃上清，用2mL PBS液洗涤2遍，重新悬于500μL的PBS液中液上机检测，用流式细胞仪测定FLAER的表达率。

统计学处理 采用软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验和Mann-Whitney U 检验，P<为差异有统计学意义。

2 结果

临床特征 PNH患者9例，男6例、女3例，年龄16～60岁，中位年龄30岁;AA患者13例，男5例、女8例，年龄7～63岁，中位年龄38;MDS患者11例，男5例、女6例，年龄41～72岁，中位年龄53岁，其中RCMD 1例，RCUD 6例，RAEB-Ⅰ2例RAEB-Ⅱ1例，5q-综合征1例;对照组15例，男6例、女9例，年龄19～61岁，中位年龄34岁。

不同方法对PNH 患者检测的比较 PNH 组患者FLAER缺失率和CD59缺失率分别为(±)%和(±)%，显著高于对照组、AA组、MDS组，差异有统计学意义(P<)。FLAER检测结果明显高于CD59检测，差异有统计学意义(P<)。其中，有2例患者，一例CD59缺失率为，FLAER缺失率为;另一例CD59缺失率为，FLAER缺失率为。

不同方法对非PNH 患者检测的比较 各组中FLAER缺失率平均值均大于CD59缺失率，但差异无统计学意义(P>)，表明在非PNH组中FLAER和CD59检测无显著差异。对照组中FLAER缺失率为，特异性100%，有3例存在CD59缺失，缺失率均小于1%。13例AA 患者中5例检测出FLAER缺失，其中4例检测出CD59缺失，1例未检测出;11例MDS患者中3例检测出FLAER缺失，其中2例存在CD59缺失，1例CD59缺失率为0。结果说明FLAER检测比CD59检测更为敏感，特异性更好。

3 讨论

到目前为止，已经发现了20多种蛋白在PNH 患者血细胞表面表达缺乏，其中红细胞膜上衰变加速因子(CD55)和反应性溶血膜抑制物(CD59)的缺失被认为是引起PNH 病理生理的主要原因。红细胞数目多、抗体表达强是灵敏度检测最好的目标细胞。尤其是在一些粒细胞减少的疾病中如AA、MDS，红细胞检测尤为重要。同时，通过比较红细胞和白细胞的数值，可以给临床提供更多信息。CD55分子在红细胞上表达较低，而CD59分子的荧光染色强且均一，近些年来已成为PNH诊断的“金标准”。然而，越来越多的研究发现检测红细胞CD59表达对PNH 的诊断有一定的局限性。

本研究发现，在PNH组的两例患者中，一例CD59缺失率为，另一例CD59缺失率为，而FLAER缺失率分别为和。可能是由于患者正处于疾病的活动期，接受输血治疗，影响了红细胞CD59的表达，导致CD59表达出现假阳性。有研究表明，在小细胞低色素性贫血时，病人的红细胞膜表面的CD59表达均有降低，但粒细胞是正常的，若只检测红细胞的CD59会造成其表达假阴性。此外，正常细胞衰老时表面分子CD59还有可能自发丢失，均可导致检测值偏离事实。随着技术不断进步，人们研究出了FLAER 技术，FLAER是Alexa-488标记的无活性的嗜水气单胞菌溶素前体的变异体，可以特异性地与GPI锚链蛋白结合，在所有具有GPI锚连蛋白的粒细胞上均有特异性表达，不会因不同细胞表达GPI锚链蛋白的多少和种类不同造成误差。由于FLAER能直接检测GPI蛋白，有助于识别真正的PNH 和免疫性血细胞减少症，明确真正的GPI阴性细胞。本研究中对照组FLAER检测缺失率均为0，与CD59相比检验结果更具有特异性;在PNH组中，FLAER的缺失率显著高于CD59，敏感性更高。FLAER也是防止门内出现污染细胞最好的抗体。如果门内污染了少量的.CD24阴性表达的细胞群，可能会被误认为是小的PNH 克隆，而FLAER 与CD24一起使用可以提高PNH检测的准确性，CD24/FLAER双阴性细胞群才是真正PNH克隆细胞群。FLAER多参数检测要求外周血标本采集后必需及时送检，否则会导致粒细胞存活率下降，细胞非特异性染色增强，影响检测效果。这在一定程度上影响了FLAER在临床上的应用。PNH 克隆的检出对于MDS和AA的临床表现、治疗及转归有重要意义。部分具有PNH 克隆的AA患者对免疫治疗效果更好，即使小于的克隆也会影响治疗效果。

对于检测出少量PNH克隆的AA患者，需监测PNH克隆数的变化，因为患者有可能发展为溶血性贫血。在本研究中，PNH 与MDS的关系只局限在低危MDS中，表现为血细胞减少，骨髓增生低下;遗传学异常发生率低，临床过程惰性进展，更多地表现为骨髓衰竭的特点。AA 组、MDS 组中FLAER的缺失率均大于CD59的缺失率。由于AA和低增生性MDS的鉴别十分困难，但到目前为止还没有报道MDS的患者进展为PNH，监测PNH 克隆对于这两种疾病的鉴别具有一定的意义。AA、MDS患者中检测出的PNH 克隆常常很小，CD59检测不易测出。在这两组中各有1例患者CD59缺失率为0，而FLAER表达均有缺失，缺失率分别为、。FLAER检测更敏感，与CD59相比灵敏度更高。由于AA、低增生性MDS和PNH 均属于骨髓衰竭性疾病，具有相似的发病机制、临床表现和生物学特性，三种疾病之间的鉴别很困难。FLAER检测与CD59相比灵敏性和特异性更高。能够早期提供更为灵敏、特异的PNH 克隆依据，在临床症状不典型、诊断不明确的疑似PNH患者，辅以FLAER检测有助于早期确诊或除外诊断。因此，FLAER高灵敏度检测PNH 克隆对这三种疾病及疾病之间的诊断鉴别及了解临床过程、预后及转归具有一定的意义。

原文： Scalable Object Detection using Deep Neural Networks——学术范 最近，深度卷积神经网络在许多图像识别基准上取得了最先进的性能，包括ImageNet大规模视觉识别挑战(ILSVRC-2012)。在定位子任务中获胜的模型是一个网络，它预测了图像中每个对象类别的单个边界框和置信度得分。这样的模型捕获了围绕对象的整幅图像上下文，但如果不天真地复制每个实例的输出数量，就无法处理图像中同一对象的多个实例。在这篇论文中提出了一个显著性启发的神经网络检测模型，它预测了一组与类无关的边界框，每个框有一个分数，对应于它包含任何感兴趣的对象的可能性。该模型自然地为每个类处理数量可变的实例，并允许在网络的最高级别上进行跨类泛化。 目标检测是计算机视觉的基本任务之一。一个解决这个问题的通用范例是训练在子图像上操作的对象检测器，并在所有的场所和尺度上以详尽的方式应用这些检测器。这一范例被成功地应用于经过区别训练的可变形零件模型(DPM)中，以实现检测任务的最新结果。对所有可能位置和尺度的穷举搜索带来了计算上的挑战。随着类数量的增加，这个挑战变得更加困难，因为大多数方法都训练每个类单独的检测器。为了解决这个问题，人们提出了多种方法，从检测器级联到使用分割提出少量的对象假设。 关于对象检测的文献非常多，在本节中，我们将重点讨论利用类不可知思想和解决可伸缩性的方法。 许多提出的检测方法都是基于基于部件的模型，最近由于有区别学习和精心设计的特征，已经取得了令人印象深刻的性能。然而,这些方法依赖于在多个尺度上详尽地应用零件模板，这是非常昂贵的。此外，它们在类的数量上是可伸缩的，这对像ImageNet这样的现代数据集来说是一个挑战。 为了解决前一个问题，Lampert等人使用分支绑定策略来避免计算所有可能的对象位置。为了解决后一个问题，Song et al.使用了一个低维部件基，在所有对象类中共享。基于哈希算法的零件检测也取得了良好的结果。 另一种不同的工作，与我们的工作更接近，是基于对象可以本地化的想法，而不必知道它们的类。其中一些方法建立在自底向上无阶级分割[9]的基础上。通过这种方式得到的片段可以使用自上而下的反馈进行评分。基于同样的动机，Alexe等人使用一种廉价的分类器对对象假设是否为对象进行评分，并以这种方式减少了后续检测步骤的位置数量。这些方法可以被认为是多层模型，分割作为第一层，分割分类作为后续层。尽管它们编码了已证明的感知原理，但我们将表明，有更深入的模型，充分学习可以导致更好的结果。 最后，我们利用了DeepLearning的最新进展，最引人注目的是Krizhevsky等人的工作。我们将他们的边界盒回归检测方法扩展到以可扩展的方式处理多个对象的情况。然而，基于dnn的回归已经被Szegedy等人应用到对象掩模中。最后一种方法实现了最先进的检测性能，但由于单个掩模回归的成本，不能扩展到多个类。 我们的目标是通过预测一组表示潜在对象的边界盒来实现一种与类无关的可扩展对象检测。更准确地说，我们使用了深度神经网络(DNN)，它输出固定数量的包围盒。此外，它为每个盒子输出一个分数，表示这个盒子包含一个对象的网络信任度。 为了形式化上述思想，我们将i-thobject框及其相关的置信度编码为最后一网层的节点值: Bounding box: 我们将每个框的左上角和右下角坐标编码为四个节点值，可以写成vectorli∈R4。这些坐标是归一化的w. r. t.图像尺寸，以实现图像绝对尺寸的不变性。每个归一化坐标是由最后一层的线性变换产生的。 Confidence: 置信度:包含一个对象的盒子的置信度得分被编码为单个节点valueci∈[0,1]。这个值是通过最后一个隐藏层的线性变换产生的，后面跟着一个sigmoid。 我们可以组合边界盒位置sli,i∈{1，…K}为一个线性层。同样，我们可以将所有置信区间ci,i∈{1，…K}作为一个s型层的输出。这两个输出层都连接到最后一个隐藏层 在推理时，我们的算法生成kbound盒。在我们的实验中，我们使用ek = 100和K= 200。如果需要，我们可以使用置信分数和非最大抑制在推理时获得较少数量的高置信框。这些盒子应该代表对象。因此，它们可以通过后续的分类器进行分类，实现目标检测。由于盒子的数量非常少，我们可以提供强大的分类器。在我们的实验中，我们使用另一个dnn进行分类。 我们训练一个DNN来预测每个训练图像的边界框及其置信度得分，以便得分最高的框与图像的groundtruth对象框很好地匹配。假设对于一个特定的训练例子，对象被标记为boundingboxesgj,j∈{1，…，M}。在实践中，pre- dictionary的数量远远大于groundtruthboxm的数量。因此，我们试图只优化与地面真实最匹配的预测框子集。我们优化他们的位置，以提高他们的匹配度，最大化他们的信心。与此同时，我们将剩余预测的置信度最小化，这被认为不能很好地定位真实对象。为了达到上述目的，我们为每个训练实例制定一个分配问题。Wexij∈{0,1}表示赋值:xij= 1，如果第i个预测被赋值给第j个真对象。这项任务的目标可以表示为 其中，我们使用标准化边界框坐标之间的el2距离来量化边界框之间的不同。此外，我们希望根据分配x优化盒子的可信度。最大化指定预测的置信度可以表示为  最终的损失目标结合了匹配损失和信心损失 受式1的约束。α平衡了不同损失条款的贡献。 对于每个训练例子，我们通过解决一个最佳的赋值x*的预测到真实的盒子 约束执行赋值解决方案。这是二部匹配的一种变体，是一种多项式复杂度匹配。在我们的应用程序中，匹配是非常便宜的——每幅图像中标记的对象的数量少于一打，而且在大多数情况下只有很少的对象被标记。然后，通过反向传播优化网络参数。例如，反向传播算法的一阶导数计算w、r、t、l和c 尽管上述定义的损失在原则上是足够的，但三次修改使其有可能更快地达到更好的准确性。第一个修改是对地面真实位置进行聚类，并找到这样的聚类/质心，我们可以使用这些聚类/质心作为每个预测位置的先验。因此，鼓励学习算法为每个预测位置学习一个残差到一个先验。 第二个修改涉及到在匹配过程中使用这些先验:不是将N个groundtruth位置与K个预测进行匹配，而是在K个先验和groundtruth之间找到最佳匹配。一旦匹配完成，就会像之前一样计算目标的置信度。此外，位置预测损失也不变:对于任何一对匹配的(目标，预测)位置，其损失定义为groundtruth和对应于匹配先验的坐标之间的差值。我们把使用先验匹配称为先验匹配，并假设它促进了预测的多样化。  需要注意的是，尽管我们以一种与类无关的方式定义了我们的方法，但我们可以将它应用于预测特定类的对象盒。要做到这一点，我们只需要在类的边框上训练我们的模型。此外，我们可以预测每个类的kbox。不幸的是，这个模型的参数数量会随着类的数量线性增长。此外，在一个典型的设置中，给定类的对象数量相对较少，这些参数中的大多数会看到很少有相应梯度贡献的训练示例。因此，我们认为我们的两步过程——首先本地化，然后识别——是一个更好的选择，因为它允许使用少量参数利用同一图像中多个对象类型的数据 我们使用的本地化和分类模型的网络架构与[10]使用的网络架构相同。我们使用Adagrad来控制学习速率衰减，128的小批量，以及使用多个相同的网络副本进行并行分布式训练，从而实现更快的收敛。如前所述，我们在定位损失中使用先验——这些是使用训练集上的均值来计算的。我们还使用α = 来平衡局部化和置信度损失。定位器可以输出用于推断的种植区以外的坐标。坐标被映射和截断到最后的图像区域。另外，使用非最大抑制对盒进行修剪，Jaccard相似度阈值为。然后，我们的第二个模型将每个边界框分类为感兴趣的对象或“背景”。为了训练我们的定位器网络，我们从训练集中生成了大约3000万幅图像，并对训练集中的每幅图像应用以下步骤。最后，样品被打乱。为了训练我们的本地化网络，我们通过对训练集中的每一幅图像应用以下步骤，从训练集中生成了大约3000万幅图像。对于每幅图像，我们生成相同数量的平方样本，使样本总数大约为1000万。对于每幅图像，样本被桶状填充，这样，对于0 - 5%、5 - 15%、15 - 50%、50 - 100%范围内的每个比例，都有相同数量的样本，其中被包围框覆盖的比例在给定范围内。训练集和我们大多数超参数的选择是基于过去使用非公开数据集的经验。在下面的实验中，我们没有探索任何非标准数据生成或正则化选项。在所有的实验中，所有的超参数都是通过对训练集。 Pascal Visual Object Classes (VOC)挑战是最常用的对象检测算法基准。它主要由复杂的场景图像组成，其中包含了20种不同的对象类别的边界框。在我们的评估中，我们关注的是2007版VOC，为此发布了一个测试集。我们通过培训VOC 2012展示了结果，其中包含了大约。11000张图片。我们训练了一个100框的定位器和一个基于深度网络的分类器。 我们在一个由1000万作物组成的数据集上训练分类器，该数据集重叠的对象至少为 jaccard重叠相似度。这些作物被标记为20个VOC对象类中的一个。•2000万负作物与任何物体盒最多有个Jaccard相似度。这些作物被贴上特殊的“背景”类标签。体系结构和超参数的选择遵循。 在第一轮中，定位器模型应用于图像中最大-最小中心方形作物。作物的大小调整到网络输入大小is220×220。单次通过这个网络，我们就可以得到上百个候选日期框。在对重叠阈值为的非最大抑制后，保留评分最高的前10个检测项，并通过21路分类器模型分别通过网络进行分类。最终的检测分数是给定盒子的定位分数乘以分类器在作物周围的最大方形区域上评估的分数的乘积。这些分数通过评估，并用于计算精确查全曲线。 首先，我们分析了本地化器在隔离状态下的性能。我们给出了被检测对象的数量，正如Pascal检测标准所定义的那样，与生成的包围框的数量相对比。在图1中，我们展示了使用VOC2012进行训练所获得的结果。此外，我们通过使用图像的最大中心面积(max-center square crop)作为输入以及使用两个尺度(second scale)来给出结果:最大中心面积(max-center crop)的第二个尺度(select3×3windows的大小为图像大小的60%)正如我们所看到的，当使用10个边界框的预算时，我们可以用第一个模型本地化的对象，用第二个模型本地化48%的对象。这显示出比其他报告的结果更好的性能，例如对象度算法达到42%[1]。此外，这个图表显示了在不同分辨率下观察图像的重要性。虽然我们的算法通过使用最大中心作物获得了大量的对象，但当使用更高分辨率的图像作物时，我们获得了额外的提升。进一步，我们用21-way分类器对生成的包围盒进行分类，如上所述。表1列出了VOC 2007的平均精度(APs)。达到的平均AP是，与先进水平相当。注意，我们的运行时间复杂度非常低——我们只使用top10框。示例检测和全精度召回曲线分别如图2和图3所示。值得注意的是，可视化检测是通过仅使用最大中心方形图像裁剪，即使用全图像获得的。然而，我们设法获得了相对较小的对象，例如第二行和第二列的船，以及第三行和第三列的羊。 在本工作中，我们提出了一种新的方法来定位图像中的对象，该方法可以预测多个边界框的时间。该方法使用深度卷积神经网络作为基本特征提取和学习模型。它制定了一个能够利用可变数量的groundtruth位置的多箱定位成本。在“一个类一个箱”方法的情况下，对1000个盒子进行非max-suppression，使用与给定图像中感兴趣的DeepMulti-Box方法相同的准则，并学习在未见图像中预测这些位置。 我们在VOC2007和ILSVRC-2012这两个具有挑战性的基准上给出了结果，在这两个基准上，所提出的方法具有竞争力。此外，该方法能够很好地预测后续分类器将探测到的位置。我们的结果表明，deepmultibox的方法是可扩展的，甚至可以在两个数据集之间泛化，就能够预测感兴趣的定位，甚至对于它没有训练的类别。此外，它能够捕获同一类物体的多种情况，这是旨在更好地理解图像的算法的一个重要特征。 在未来，我们希望能够将定位和识别路径折叠到一个单一的网络中，这样我们就能够在一个通过网络的一次性前馈中提取位置和类标签信息。即使在其当前状态下，双通道过程(本地化网络之后是分类网络)也会产生5-10个网络评估，每个评估的速度大约为1个CPU-sec(现代机器)。重要的是，这个数字并不与要识别的类的数量成线性关系，这使得所提出的方法与类似dpm的方法非常有竞争力。